本研究成果は，2014年5月4日（英国時間）に英国科学雑誌「Nature Chemistry」のオンライン速報版で公開されました。

研究のポイント

• バイオマーカーである複雑な生体分子に応答して溶けるヒドロゲルの開発に成功
• 水とゲル化剤と酵素を混ぜるだけで簡単に作製できる
• 簡便で手軽な診断材料や抗体を症状に応じて投与できる薬物放出材料として期待

研究の背景と経緯

　水を媒体とするヒドロゲルは，その生体適合性の高さから，診断材料，薬物放出担体，細胞培養基材など，さまざまな医療応用が期待される魅力的な材料です。このようなヒドロゲルが特定の分子の存在やその量を識別して溶けたり，再度固まったりできれば，高度な機能を持つ新しい医療材料の開発につながると期待されます。しかし，これまでに開発されたヒドロゲルが識別できる分子は，構造が単純なものに限定されていました。また，識別の対象となる標的分子ごとに新たなゲル化剤の設計と開発が求められ，その都度多大な労力を必要としていました。さらに複数の標的分子が同時に存在するかどうかを見分けるヒドロゲルの開発に関しては，その設計指針さえありませんでした。

研究の内容

　本研究グループは，小分子化合物が自律的に構造を作り出す「自己組織化注１）」という現象によってナノサイズ（ナノは１０億分の１）の構造体を開発し，その機能化に取り組んできました。とくに，水中でナノサイズの極細繊維（ナノファイバー）となり，そのナノファイバーが絡み合うことでヒドロゲル（超分子ヒドロゲル）を形成する小分子化合物（ゲル化剤）の高機能化を進め，非常に低濃度でゲル化する化合物の開発に成功してきました（図１）。
　今回，それらの知見を基に，酸化反応あるいは還元反応によって溶けるという特徴をもった反応性超分子ヒドロゲルをそれぞれ開発しました（図１ａ）。

(1) 酸化反応応答型ヒドロゲル

　酸化反応によって溶けるヒドロゲルを形成するゲル化剤（ＢＰｍｏｃ－Ｆ３）は，活性酸素種（ＲＯＳ）の中で過酸化水素を選択的に見分けて溶けることを明らかにしました（図２ａ）。過酸化水素は，各種オキシダーゼ（酸化酵素）がその基質を酸化する時に生成することが知られています。そこで，ＢＰｍｏｃ－Ｆ３が形成するヒドロゲルにいろいろなオキシダーゼを埋め込んだところ，内包したオキシダーゼの基質をヒドロゲルに添加した時にのみゲルが溶けることを見いだしました（図２ｃ）。例えば，グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）を内包させたヒドロゲルは，グルコース（ブドウ糖）のみに応答して溶け（図２ｃの１列目），サルコシンオキシダーゼ（ＳＯｘ）を内包させたヒドロゲルは，サルコシンのみに応答して溶ける（図２ｃの２列目）ことを実証しました。この結果は，ヒドロゲルの中でオキシダーゼが十分にその活性を保持し，基質を酸化する際生成した過酸化水素がヒドロゲルを溶かしているということを意味しています（図２ｄ）。つまり，１種類のゲル化剤が形成するヒドロゲルに酵素を選んで混合するだけで，さまざまな生体分子（グルコース（糖尿病のバイオマーカー），サルコシン（前立腺癌のバイオマーカー），尿酸（痛風のバイオマーカー），コリンなど）に応答して溶けるヒドロゲルが作製できることになります。このように多様な生体分子を見分けることのできるヒドロゲルはほかに類をみません。さらに，ヒト血漿を用いた実験では，高血糖症に対応する濃度のグルコースが存在する時だけ溶けるヒドロゲルも作製可能であることを実証しており（図２ｂ），今後，診断材料の開発などの医療応用に幅広い貢献が期待できます。

(2) 還元反応応答型ヒドロゲル

　還元反応によって溶けるヒドロゲルを形成するゲル化剤（ＮＰｍｏｃ－Ｆ２）は，ニトロ還元酵素（ＮＲ）注２）と呼ばれる酵素を内包させておくことで，還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の存在を選択的に見分けることを明らかにしました（図３ａ）。ＮＡＤＨは，ＮＡＤ依存性酵素が基質を酸化する際に酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）から再生されることが知られています。そこで，ＮＡＤ依存性酵素の１つである乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）とＮＡＤ＋とＮＲを，ＮＰｍｏｃ－Ｆ２が形成するヒドロゲルに同時に内包させたところ，乳酸を添加した時にヒドロゲルが溶けることを見いだしました（図３ｂ）。この結果は，ゲルの中で乳酸がＬＤＨによって酸化され，その際ＮＡＤ＋から再生されたＮＡＤＨがゲル化剤と反応し，ヒドロゲルを溶かしていることを示しています（図３ｃ）。ちなみに乳酸はがん組織周辺で濃度が上昇することが知られています。

(3) 酸化反応応答型ヒドロゲルと還元反応応答型ヒドロゲルの複合化

　さらに，上記の２種類のゲル化剤および数種類の酵素を混合したヒドロゲルは，それぞれが識別する生体分子が同時に存在する時のみに溶けることも実証しました。すなわち，グルコースのみ，あるいは，ＮＡＤＨのみでは溶けず，グルコースとＮＡＤＨが両方存在する時においてのみ溶ける自律応答型のヒドロゲルの開発に成功しました（図４）。また，そのヒドロゲルに蛍光色素を修飾した抗体(IgG)を閉じ込めておくと，グルコースとＮＡＤＨが両方存在する時においてのみ抗体を放出することも明らかにしました（図４ｃ）。

今後の展開

　今回開発したヒドロゲルは，水とゲル化剤と酵素を混ぜるだけで簡単に作製できます。さらに抗体のようなバイオ医薬品をそのヒドロゲルのなかに閉じ込めておき，バイオマーカーの存在を識別し放出させることも可能です。
　このように，化学反応の特異性を組み込んだ小分子化合物からボトムアッププロセス注３）で作成したナノファイバーからなるヒドロゲルと酵素反応を組み合わせる手法は広く一般化することが可能であり，診断材料，薬物放出材料，再生医療用細胞培養基材など，さまざまな医療材料に「これまでにない自律的に考えて応答するという新たな機能」を付与できると期待されます。

参考図

図１　ゲル化剤の分子構造と自己組織化および化学反応の模式図
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ａ：酸化反応に応答するゲル化剤（ＢＰｍｏｃ－Ｆ３）と還元反応に応答するゲル化剤
　　（ＮＰｍｏｃ－Ｆ２）の分子構造

ｂ：ＢＰｍｏｃ－Ｆ３の自己組織化および過酸化水素に応答した酸化反応の模式図

ｃ：ＢＰｍｏｃ－Ｆ３が形成するナノファイバーの顕微鏡写真
　　（左：透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真，右：共焦点レーザ走査型顕微鏡（ＣＬＳＭ）写真）

図２　酸化反応応答型ヒドロゲル（ＢＰｍｏｃ－Ｆ３）
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ａ：バイアル瓶中に作成した過酸化水素に選択的に応答するヒドロゲルの写真　（ヒドロゲルはバイアル瓶を逆さにしても流れ落ちないが，過酸化水素を添加後のサンプル（Ｈ２Ｏ２とラベル：左から２番目）は溶けて（ゾル化し）流れている）。

ｂ：スライドガラス上にスポットしたヒドロゲル（直径約４ｍｍ）にグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）を内包させ，異なる濃度のグルコースを含むヒト血漿を添加し，水で洗った後のスライドガラスを上から撮影した写真（ヒドロゲルは水で洗ってもスポットとして残っているが，高濃度のグルコースを含むヒト血漿を添加したヒドロゲルは溶けてゾルとなり，洗い流され残っていない）。

ｃ：スライドガラス上にスポットしたヒドロゲル（直径約４ｍｍ）にオキシダーゼを内包させ，標的分子を添加し，水で洗った後のスライドガラスを上から撮影した写真（ヒドロゲルは水で洗ってもスポットとして残っているが，溶けたゾルは洗い流され残っていない）。ＧＯｘ：グルコースオキシダーゼ，ＳＯｘ：サルコシンオキシダーゼ，ＣＯｘ：コリンオキシダーゼ，ＵＯｘ：尿酸オキシダーゼ。

ｄ：オキシダーゼを内包したヒドロゲルがそれぞれのオキシダーゼの基質を添加した時に応答することを模式的に示したスキーム。

図３　還元反応応答型ヒドロゲル（ＮＰｍｏｃ－Ｆ２）
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ａ：バイアル瓶中に作成したＮＡＤＨに選択的に応答するヒドロゲルの写真（ヒドロゲルはバイアル瓶を逆さにしても流れ落ちないが，ＮＡＤＨを添加後のサンプル（ＮＡＤＨとラベル：右）は溶けて（ゾル化し）流れている）。

ｂ：スライドガラス上にスポットしたヒドロゲル（直径約４ｍｍ）に酵素およびＮＡＤ＋を内包させ，標的分子を添加し，水で洗った後のスライドガラスを上から撮影した写真（ヒドロゲルは水で洗ってもスポットとして残っているが，溶けたゾルは洗い流され残っていない。右から２番目と３番目のスポットを比較すると乳酸を添加することでヒドロゲルが溶けていることが分かる）。ＬＤＨ：乳酸脱水素酵素，ＮＲ：ニトロ還元酵素。

ｃ：ＬＤＨとＮＲとＮＡＤ＋を内包したヒドロゲルが乳酸あるいはＮＡＤＨを添加した時に応答することを模式的に示したスキーム。

図４　酸化反応応答型ヒドロゲル（ＢＰｍｏｃ－Ｆ３）
（クリックすると拡大します）

ａ：スライドガラス上にスポットした複合化ヒドロゲル（直径約４ｍｍ）に，標的分子を添加し，水で洗った後のスライドガラスを上から撮影した写真（ヒドロゲルは水で洗ってもスポットとして残っているが，溶けたゾルは洗い流され残っていない。グルコースとＮＡＤＨを両方添加したスポット（右下）のみヒドロゲルが溶けていることが分かる。ＮＡＤＨとグルコースをインプット情報としてＡＮＤ型の論理演算を実行してゲルが溶けていることを意味する結果である）。

ｂ：複合化したヒドロゲルがグルコースおよびＮＡＤＨ両方を添加した時のみ応答することを模式的に示したスキーム。

ｃ：ヒドロゲルに蛍光色素を修飾した抗体を閉じ込めておき，その上にバッファーを加え，さらに，グルコースのみ（0,1），ＮＡＤＨのみ(1,0)，グルコースとＮＡＤＨの両方(1,1)，あるいはいずれも含まない(0,0)水溶液を添加し，８時間後に撮影した写真（蛍光を可視化）。ヒドロゲルからバッファー中に放出された抗体の割合（％）の時間変化を蛍光強度から求めたプロット。

用語解説

• 注１）自己組織化
  ：分子などが非共有結合性相互作用などによって，自分自身で高次の大きな組織や構造を作り出す性質
• 注２）ニトロ還元酵素（ＮＲ）
  ：ＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）を補因子とし，ニトロ基を還元する酵素。活性化にＮＡＤＨを必要とする
• 注３）ボトムアッププロセス
  ：分子や原子といった小さな材料を部品として，その組み合わせから最終的に大きな材料やシステムを作り上げる方法。大きな材料を削る・切るなどして微細に加工し，半導体などの小さな材料を作成するトップダウンアプローチとは反対の方法

論文タイトル

Installing Logic-Gate Response to a Variety of Biological Substances in Supramolecular Hydrogel-Enzyme Hybrids
（超分子ヒドロゲル－酵素ハイブリッドへのさまざまな生体物質に対する論理演算応答の導入）